Anal Chem|兩親性適配體電極原位檢測單細胞中的ATP
發(fā)布時間：2024-07-24
作者：江蘇瑞明生物科技有限公司
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近日，湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院在Anal Chem雜志發(fā)表了題為“In Situ Measurement of ATP in Single Cells by an Amphiphilic Aptamer-Assisted Electrochemical Nano-Biosensor”論文，采用兩親適配體修飾的納米電極實現(xiàn)了單細胞水平的ATP原位檢測。
(A) 兩親性適配體的圖示和及(B) 在細胞核、細胞質(zhì)和細胞外空間中原位檢測 ATP。
單個活細胞中 ATP的原位和定量檢測對于理解疾病的生理和病理過程非常必要，然而，ATP 很難在單細胞中檢測到，因為它是非電活性的，而且含量低。超微電極由于其體積小和靈敏度高的特征，可用于單細胞分析，而適配體是一類特異性結(jié)合靶分子的單鏈寡核苷酸，由于其操作簡單、免疫原性低、成本低，已成為一種強大的靶向配體。本研究介紹了一種基于兩親適配體輔助碳纖維納米電極 (aptCFNE) 的電化學(xué)納米生物傳感器，具有高信噪比。該電極通過實時單細胞多模態(tài)分析儀可以快速、選擇性地檢測單個 HeLa 細胞的細胞核、細胞質(zhì)和細胞外間隙中的 ATP 含量，本研究在還記錄了單細胞水平上的抗癌藥物治療效果，這對于理解ATP相關(guān)的生物學(xué)過程和藥物篩選具有重要意義。
圖 1. (A) 制備好的 CFNE 示意圖。 (B) 所準(zhǔn)備的 CFNE 尖端的掃描電子顯微圖像。插圖：相應(yīng)的尖端視圖。 (C) CFNE 尖端碳纖維的直徑分布。 (D) 實時單細胞多模態(tài)分析儀的拍攝照片。 (E) 放大的照片顯示用于固定和移動納米電極的支架和用于電化學(xué)檢測的三電極系統(tǒng)。 (F) 在含有 2 mM Fc-CH2OH 的 PBS (pH 7.4) 中以裸 CFNE 獲得的典型 CV。掃描速率，50 mV s?1
為了獲得更好的細胞內(nèi)檢測性能，本研究對系統(tǒng)的反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，包括適配體濃度和 ATP 反應(yīng)時間。選擇 1 μM 作為最佳適配體濃度，aptCFNE 可以在 1 分鐘內(nèi)響應(yīng) ATP，然后在 5 分鐘時達到一個平臺。aptCFNE 對水溶液中 ATP 濃度的 DPV 響應(yīng)（圖2C）結(jié)果表明，納米電極之間的微小差異滿足了平行實驗的要求。圖 3D在ΔI/I0和ATP濃度之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，確保了納米生物傳感器對ATP傳感的優(yōu)異靈敏度。通過分別與 ATP 類似物（例如 GTP、CTP、UTP 和 ADP）、葡萄糖 (glu) 和細胞培養(yǎng)基反應(yīng)，進一步研究了 aptCFNE 的選擇性。該納米傳感器表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏度，使其能夠識別復(fù)雜系統(tǒng)中的 ATP。
圖 2. (A) 適配體濃度和 (B) 納米電極孵育時間對 ΔI/I0的影響（增加峰值電流 ΔI = In? I0）和 0.25 mM ATP。(C) aptCFNE 在 10 mM PBS (pH 7.4) 中的兩組 DPV 響應(yīng)包含不同的 ATP 濃度，范圍從 0、0.05、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 到 2.0 mM (a-h)。(D) ΔI/I0和 ATP 濃度之間的線性關(guān)系。(E) aptCFNEs 對 1.0 mM ATP、5.0 mM ATP 類似物（GTP、CTP、UTP 和 ADP）、25 mM 葡萄糖和細胞培養(yǎng)基的選擇性。(F) aptCFNE 和 CFNE 對在 PBS (pH 7.4) 中連續(xù)添加 ATP（1、3、6 和 10 mM）的安培電流響應(yīng)。
在亞細胞水平上原位檢測 ATP 對于分析疾病特異性基因表達和細胞異質(zhì)性具有重要意義。在實時單細胞多模態(tài)分析儀的輔助下，這種納米傳感器被精確地移動到亞細胞水平的單個 HeLa 細胞中，并以良好的空間分辨率進行了電化學(xué)分析（圖1D、E）。本實驗中，使用熒光染料（Calcein-AM 和 PI）對 HeLa 細胞進行染色并研究其活力。在從單個細胞中插入和去除 aptCFNE 后，細胞的熒光圖像保持不變，證實單個細胞仍然存活（圖 3B) 。將納米傳感器在 ATP 內(nèi)的細胞培養(yǎng)基中孵育 5 分鐘，并進行檢測，如圖所示圖 3C，隨著 ATP 濃度從 0.05 增加到 5 mM，信號響應(yīng)逐漸增加，跨越 2 個數(shù)量級。圖 2D 顯示 ΔI/I0和 ATP 濃度之間具有良好的線性關(guān)系，檢出限為4.5 μM (S/N =3)，可用于單細胞水平ATP的檢測。
圖 3. (A) 實時單細胞多模態(tài)分析儀控制 aptCFNE 進入 (a) 細胞核、(b) 細胞質(zhì)和 (c) 細胞外空間的明場顯微鏡圖像。 (B) 用 Calcein-AM 染色的 HeLa 細胞的代表性明場和熒光圖像。比例尺：20 微米。 (C) aptCFNEs 在細胞培養(yǎng)基中的 DPV 響應(yīng)包含不同的 ATP 濃度，范圍從 0 到 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、2、3、4 和 5 mM (a-m)。 (D) ΔI/I0和 ATP 濃度之間的相應(yīng)校準(zhǔn)圖。(E) 插入不同區(qū)域后 aptCFNEs 當(dāng)前響應(yīng)的直方圖。(F) 計算的 15 個單獨 HeLa 細胞的 ATP 濃度的箱形圖。
細胞內(nèi)ATP的變化與許多疾病和病理密切相關(guān)，研究外部藥物刺激對細胞狀態(tài)的影響非常重要。最后，所制備的電化學(xué)納米生物傳感器被用于抗癌藥物（依托泊苷和寡霉素）對ATP增加和減少的實驗。研究發(fā)現(xiàn)，依托泊苷可以增加細胞內(nèi) ATP 含量。這和報道的依托泊苷的作用機制相一致，包括抑制核苷轉(zhuǎn)移和DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，并能促進ATP的合成。而寡霉素的功能是通過抑制氧化磷酸化來減少 ATP 合成，細胞核、細胞質(zhì)和細胞外空間的峰值電流分別從 0.059 降低到 0.047 nA，從 0.053 降低到 0.038 nA，從 0.046 降低到 0.032 nA。這些結(jié)果對于理解單細胞相關(guān)的生理過程和藥物篩選具有重要意義。
圖 4. 9 個單獨的 HeLa 細胞在用（A） 100 μM 依托泊苷處理 20 分鐘和 (C) 3 μg/mL 寡霉素處理 3 小時后在 (a) 細胞核、(b) 細胞質(zhì)和 (c) 的亞細胞位置的峰值電流細胞外空間。 (B, D) 用依托泊苷和寡霉素處理后用 Calcein-AM 染色的活 HeLa 細胞的熒光圖像。比例尺：20 微米。
In Situ Measurement of ATP in Single Cells by an Amphiphilic Aptamer-Assisted Electrochemical Nano-Biosensor
Min Jiang, Xiaoxue Xi, Zhen Wu,* Xiuhua Zhang, Shengfu Wang, and Wei Wen*Cite This: Anal. Chem. 2022, 94, 14699?14706
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